結構預測能不能用AlphaFold, Chai-1 and pLDDT
預測結構很方便，但它最不準的地方剛好是你最在意的地方。
01一句話只有一句
pLDDT 低的地方不是預測失敗，是分子真的有很多個答案。
02Why should I care?我為什麼要讀這頁
因為你要篩的變體沒有晶體結構，而且不會有人為了你的 funnel 去解一批。
funnel 要篩幾十上百個 Cas9 變體，不可能每一個都等一次 X-ray。所以你一定會用到預測結構，唯一的問題是：放在 workflow 的哪一層。
這個答案已經用最貴的方式買回來了。用 Chai-1 預測的結構當三元複合體 MD 的起點，跑完 replica，逐殘基 top-8 接觸殘基的跨 replica 共享是 0/8、Spearman ρ ≈ −0.03 —— 跟丟骰子一樣（細節見該用哪個結構起頭）。座標不能用。
但同一次預測吐出來的信心分布卻指到了對的地方：REC lobe 的 pLDDT 是 78 到 85、RuvC-I 是 80，都很高；HNH 只有 62.9，而且只有 35% 的殘基達到 70；target DNA 是 64 到 65；全域最低的是 HNH 的 L1 linker 區段 765 到 809，只有 46。而你獨立用 MD 量到的是：apo 蛋白裡 HNH 的 RMSF 是 1.86 Å，全域最高。逐殘基 RMSF 與 pLDDT 的相關係數是 ρ = −0.36。
（這個對照有一個必須先說出口的限制：pLDDT 來自蛋白＋sgRNA＋DNA 的三元預測，RMSF 來自 apo 蛋白的 MD，兩邊不是同一個系統。所以它只在蛋白端成立，而且只到定性層次。後面 Reviewer Thinking 那節會把這個洞攤開來講。）
座標不能用，信心圖能用。 這一頁講的就是這件事，以及怎麼把它變成 workflow 最前面一道近乎零成本的閘。
用你熟的語言講：這有點像看軟聲子模。頻率低不代表你的計算錯了，代表那個方向的位能面本來就平、原子本來就容易動。pLDDT 低同樣不等於「模型失能」，它更常是「這個自由度沒有唯一解」。這只是一個類比不是推導 —— 但它會讓你在看到一片紅色的 HNH 時，第一反應是「這裡有東西」而不是「這模型爛」。
03What這是什麼
lDDT（local Distance Difference Test） 是一個不做結構疊合的比對指標。它對每個原子取一個鄰域半徑（原始定義的預設是 15 Å），比較預測結構與參考結構在這個鄰域裡的原子間距離有多少落在容差內。因為不疊合，所以一整塊 domain 被擺錯位置，不會拖垮它內部的 lDDT。
pLDDT 是模型對自己每個殘基的 lDDT 所做的預測值，範圍 0 到 100。AlphaFold 慣用的分帶是：
- > 90：very high，主鏈與側鏈大多可信。
- 70 到 90：confident，主鏈可信。
- 50 到 70：low。
- < 50：very low，常被當成 disorder 的指標。
上面那組分帶是 AlphaFold2 與 AlphaFold Protein Structure Database 時代訂出來的使用慣例，不是物理常數。pLDDT 的定義是「模型對自己的 lDDT 所做的預測」，而每一代模型的信心頭都是各自訓練出來的 —— 沒有任何機制保證 Chai-1 的 70 分跟 AlphaFold2 的 70 分代表同一個可靠度。所以跨模型比較 pLDDT 絕對值是沒有意義的，你只能在同一個模型、同一套設定內做相對比較。要知道你手上這個模型的分帶落在哪，唯一可靠的辦法是自己校準：拿一組有實驗結構的序列，把預測的 pLDDT 對實際算出來的 lDDT 畫散佈圖，看它準不準、偏哪一邊。這件事沒有人會幫你做。
最關鍵的一句：pLDDT 是局部量，它不告訴你 domain 之間的相對位置對不對。 兩塊各自 pLDDT 90 的 domain，完全可以被擺在錯誤的相對方位。要問「介面對不對」，該看的是 PAE（predicted aligned error） 矩陣的 off-diagonal 區塊，以及 ipTM。PAE 的定義要記準：把預測結構疊合在殘基 y 上時，模型預期殘基 x 的位置誤差有多大（單位 Å）—— 它天生問的就是「兩個位置的相對關係對不對」，正好是 pLDDT 問不到的那一半。
這件事對你特別要命，因為你要的就是介面。 Cas9 的科學問題是 HNH 相對 RuvC 擺在哪、REC3 對 heteroduplex 抓得多緊 —— 這些全部是 domain 對 domain 的關係，而 pLDDT 對它們幾乎是盲的（lDDT 的鄰域半徑就那麼大，跨 domain 的資訊只有介面那一圈殘基沾得到一點，整體擺放對不對它反映不出來）。
Chai-1 是 Chai Discovery 於 2024 年釋出的多模態結構預測模型，能同時處理蛋白、核酸與小分子，同樣輸出 pLDDT、PAE 與 ipTM。有兩件事要先講清楚：授權上，權重與推論程式碼是以「非商業用途」釋出（網頁介面另可免費用於商業用途），你要在自己的叢集上跑走的是前者；效能上，「與 AlphaFold3 相當」是作者技術報告的自評，不是第三方獨立 benchmark，引用時要照這樣寫。下面那組實測數字就是用它跑出來的。
一次 SpCas9 三元複合體預測的實測信心分布長這樣：
| 區域 | Chai-1 pLDDT | 落在哪一帶 |
|---|---|---|
| REC lobe | 78–85 | confident |
| RuvC-I | 80 | confident |
| HNH（775–908） | 62.9（僅 35% 殘基 ≥ 70） | low |
| target DNA | 64–65 | low |
| HNH L1 linker 區段 765–809 | 46 | very low，全域最低 |
文獻裡的 L1 linker 通常指 765 到 780（見 Cas9 的 domain 架構），而上表標出的低信心窗是 765 到 809 —— 它往後多含了 HNH N 端的頭三十個殘基。所以嚴格講這一列是「L1 鉸鏈加上 HNH 的入口段」，不是純粹的 L1。這不影響結論（那整段都很不確定），但寫進論文時要把區間定義寫清楚，不要讓讀者以為 46 是 765–780 的值。
04Why為什麼重要
因為誤差分布不是隨機的，它反映的是訓練資料裡這個區域有沒有唯一的構形答案。
HNH 的 pLDDT 低，不是因為它是一團爛泥。HNH 是一個折疊良好的核酸酶 domain。最合理的解釋是：PDB 裡的 HNH 處在各種不同的構形 —— 4UN3 抓到的是未活化的 checkpoint、5F9R 抓到的是 primed for cleavage、近年 cryo-EM 抓到的是 R-loop 延伸途中的中間態。模型看到的是一個多峰分布，被要求輸出單一結構時，它只能誠實地說「我不確定」。
它不是不知道，它是知道有很多個答案。 但這句話的身分要標清楚：它是把兩件各自有文獻支持的事實（HNH 在 docked／undocked 之間大幅擺動；低 pLDDT 常落在柔性或多構形區）接起來的推論，不是文獻已經證實的因果。當工作假說用沒問題，要寫進論文就得附上自己跑的 per-residue pLDDT 與 PAE 圖當證據。
這給了 ρ = −0.36 那個反相關一個很自然的解釋：預測不確定的地方，往往就是分子真的在動的地方。而 RMSF 那頁記的是兩個失敗模式完全不同的方法同時指向 HNH —— Chai-1 的低 pLDDT 與 MD 的高 RMSF（apo 1.86 Å、完整三元 1.61 Å，兩者都是全域最高）。兩個獨立方法收斂到同一個結論，這種交叉驗證在 methodology paper 裡比任何單一方法的高精度都值錢。（序列保守性訊號有時被當成第三個獨立證據，但那需要另外做逐 domain 的聚合分析才能支撐，不能直接算進來。）
但同一件事也是最壞的巧合：你最在意的區域，剛好就是最低信心的區域。 REC lobe 的 78 到 85 很漂亮，可是 REC lobe 不是你的瓶頸；HNH 與 target DNA 才是，而它們一個 62.9、一個 64 到 65。
pLDDT 高的地方你不需要它，pLDDT 低的地方你不能信它。 但這張分布圖是你跑預測時順手就有的、可與 MD 交叉驗證的證據，而且很少有人拿它來做事。
05How怎麼做
1. 跑預測的時候，把 pLDDT 與 PAE 完整存下來，不要只留 PDB。
多數人只保留座標檔就丟掉信心資訊。那是這一整頁裡唯一真正有用的東西，別丟。
2. 把 pLDDT 按 domain 聚合，畫成沿序列的曲線加 domain 帶。
用 Cas9 的 domain 架構 那份殘基編號分組。逐殘基曲線太吵，domain 級才看得出結構。同時報「該 domain 有多少比例的殘基 ≥ 70」—— 上表的 HNH 是 35%，這個比例比平均值 62.9 更能說明問題，因為它告訴你分布有多分裂。
3. 看 PAE 的 off-diagonal 區塊，這步不能省。
具體做法：把 PAE 矩陣按 domain 切成區塊，看 HNH 對 RuvC、HNH 對 REC 的區塊是不是紅的。如果是，代表模型不知道 HNH 該擺哪 —— 那你就不能用這個結構定義任何 HNH 相關的距離型 collective variable。這是一個明確的 go / no-go 判準，不是主觀感覺。
4. 有晶體結構可對照時，量 domain 級的相對擺放。
Cas9 有 5F9R，你的變體大多沒有。所以要趁 WT 有對照的時候把「預測跟晶體差多少」量出來，特別是把 RuvC 疊合之後 HNH 的位移。那個數字就是你日後外推到無結構變體時的誤差尺規。
5. 跑完 MD 後，把逐殘基 RMSF 對 pLDDT 做 Spearman。
上面那組資料量到 ρ = −0.36。這是一個幾乎免費的交叉驗證，而且非常少人報。三個附帶條件要跟數字一起寫下來：（a）這是相關不是換算，理由見下一節；（b）兩邊必須是同一個系統的同一組殘基 —— 這裡的 ρ 是拿三元預測的 pLDDT 去對 apo 蛋白 MD 的 RMSF，少了核酸，所以它只能講蛋白，不能拿來替 target DNA 的低 pLDDT 背書；（c）把估計量寫清楚，Spearman 與 Pearson 給的數字不一樣，跑的時候就要當場記下來，事後補記幾乎一定會漏。
6. 多 seed 跑幾次，量 pLDDT 自己的散布。
這是所有「用 pLDDT 排序變體」的想法的守門檢查。如果變體之間的 pLDDT 差異比同一序列不同 seed 之間的散布還小，那個排序就沒有意義。
成本： 單卡分鐘到小時等級。相對於一條 535,265 原子、87 ns 的 H100 軌跡，這幾乎是免費的。在可同時執行的 job 數與磁碟配額都有硬性上限的現實下，任何能在跑 MD 之前就砍掉候選的便宜篩子都值錢 —— 前提是你知道它能砍什麼、不能砍什麼。
06When什麼時候用
- 當變體篩選的前置分級器。 每個變體跑一次預測，看突變落在哪個信心帶、以及整體 pLDDT 相對 WT 有沒有系統性下降。相對於後面每一層，這是最便宜的第一道閘。
- 當「該把 enhanced sampling 的預算花在哪」的指路標。 低 pLDDT 與高 RMSF 的交集就是值得投資的區域。目前這個交集只在 HNH 上真的成立（pLDDT 62.9 對上 apo MD 的 RMSF 1.86 Å）；L1 linker 區段只有 pLDDT 那一邊的證據（46），MD 那一邊還沒單獨量過，所以它是候選、不是結論。
- 當跨方法交叉驗證的一角。 Chai-1 pLDDT 與 MD RMSF 同時指向 HNH，這個收斂本身就是可以寫進論文的論點。
- 當結構完全不存在時的唯一選項。 但要降級使用：只信 domain 內部的折疊，不信 domain 之間的擺放。
- 當你要證明「某個區域確實是多構形的」時。 低 pLDDT 加上 PAE off-diagonal 的紅色區塊，配上實驗上已知的多個構形（4UN3 checkpoint 對 5F9R primed），是一個很有說服力的三角驗證。
07When NOT什麼時候別用
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不要用預測結構當三元複合體生產 MD 的起點。 為什麼會壞： pLDDT 衡量局部、不衡量介面，而介面正是你要的東西；預測的介面幾何有系統性偏差，每條 replica 從那個偏差出發往不同方向鬆弛，最後收斂到互不相干的接觸模式。怎麼看出它壞了： 這個失敗有乾淨的指紋 —— 跨 replica 的逐殘基共享度掉到隨機水準。實測是 0/8 共享、ρ ≈ −0.03。診斷法是換一個晶體起點重跑，看共享度會不會跳起來（結果是 3/8、Jaccard 0.48、Spearman +0.77）。
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不要把 pLDDT 當成 B-factor 或 RMSF 的代用品。 為什麼會壞： 它們相關但不等價。上面那組實測是 ρ = −0.36，那是「有訊號」，不是「可換算」。ρ² 大約在 0.13 的量級（嚴格說 Spearman 係數的平方不等於線性回歸的 R²，但量級足以說明問題）：逐殘基層次上絕大部分的變異沒有被解釋。拿 pLDDT 去預測某個殘基會晃幾埃，會錯得很難看。怎麼看出它壞了： 直接畫散佈圖，看點雲有多胖。只報相關係數不畫圖，是這類過度解讀最常見的溫床。
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不要用 pLDDT 排序變體的功能。 為什麼會壞： pLDDT 衡量的是「模型對這個座標有多少把握」，不是「這個蛋白穩不穩」，更不是「它切得準不準」。而且點突變幾乎不改變 MSA，兩個變體之間的 pLDDT 差異多半落在 run-to-run 雜訊裡。怎麼看出它壞了： 同一條序列換幾個 seed 跑，量 pLDDT 的散布。變體之間的差異比這個散布小，排序就是雜訊。
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不要在低 pLDDT 區域定義 collective variable 或量化距離。 為什麼會壞： L1 linker 區段 765 到 809 的 pLDDT 只有 46，那段座標基本上是模型在猜。任何以 HNH 質心或 L1 幾何為基礎的 CV，在預測結構上等於在量一個猜出來的數。怎麼看出它壞了： 跑幾個 seed，看那個 CV 的初始值散多開。初始值就散得很開，後面跑多久都救不回來。
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不要因為 pLDDT 高就相信 domain 的相對擺放。 為什麼會壞： lDDT 的定義本來就是局部、不疊合的，兩塊各自 90 分的 domain 可以被擺在完全錯誤的相對方位，而 pLDDT 幾乎反映不出這件事（只有介面那一圈殘基的鄰域會被影響到，整塊的方位錯不錯它答不出來）。怎麼看出它壞了： 看 PAE 的 off-diagonal 區塊，不要看 pLDDT。這是兩個不同的問題，用錯指標是這個領域最普遍的誤用。
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不要把「HNH pLDDT 低」直接讀成「HNH 是 disordered」。 為什麼會壞： HNH 是折疊良好的核酸酶 domain，它低信心是因為相對擺放多解，不是因為它自己散掉。把它講成 disordered，接下來你所有的推論方向都會歪 —— 例如去做二級結構穩定性分析，那完全問錯了問題。怎麼看出它壞了： 看 HNH 內部的 PAE 區塊（應該相對乾淨）對比它與其他 domain 的 off-diagonal 區塊（應該很紅）。內乾淨、外紅，就是「摺疊沒問題、擺放不確定」。
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不要跨模型比較 pLDDT 絕對值。 為什麼會壞： 每一代模型的信心頭是各自訓練的，同一個分數對應到的真實準確度不一樣；你比出來的是校準差異，不是結構差異。怎麼看出它壞了： 用兩個模型跑同一條序列，把兩條 pLDDT 分布疊在一起看中位數與四分位距。連分布形狀都不一樣，就代表這兩個數字不能放在同一張表裡。
08Project Lens跟我的 project 多相關
為什麼是四星而不是五星： 因為它最貴的那個用途已經被自己的數據判掉了。
用 Chai-1 結構當生產 MD 的起點，逐殘基 top-8 接觸的跨 replica 共享是 0/8、ρ ≈ −0.03。那不是「不夠好」，那是隨機。換成 5F9R 晶體之後，同一組分析變成 3/8 共享、Jaccard 0.48、Spearman +0.77。既然預測結構不能坐在生產 MD 的上游，這個最高價值的位置就被排除了，它就不可能是五星。
為什麼是四星而不是二三星： 三個站得住的理由。
- 信心分布本身是免費的訊號，而且蛋白端已經被獨立驗證過。 HNH 62.9（僅 35% 殘基 ≥ 70）、L1 linker 區段 765 到 809 低到 46 —— 這兩處都落在獨立用 MD 找到的高柔軟度區（apo 的 HNH RMSF 1.86 Å 為全域最高），逐殘基層次的反相關是 ρ = −0.36。兩個機制完全不同的方法在 HNH 上收斂，是 methodology paper 的硬通貨，而其中一個方法的成本近乎為零。但 target DNA 那個 64 到 65 目前沒有可用的 MD 佐證：算 ρ 的那條 MD 是 apo 蛋白、系統裡根本沒有 DNA，而完整三元的 DNA RMSF 跨 4 條 replica 的 CV 是 59.1%，本來就落在 noise tier。它現在只是一個待驗證的旗標，不能算進交叉驗證裡。
- 你的變體沒有晶體結構，這是硬事實。 funnel 要覆蓋整個變體空間，預測是唯一辦得到的結構來源。問題從來不是「能不能用」，而是「放在第幾層、用它的哪一部分」。
- 成本符合硬約束。 單卡分鐘到小時級。在算力配額是硬約束的前提下，一個能在燒 GPU 之前先分級的篩子，價值不在它有多準，在它有多便宜。
具體怎麼用： 放在 Gate 0 與 Gate 1 當分級器與指路標，不當 Gate 2 之後的座標來源。生產 MD 一律從晶體起頭。預測結構的兩個合法角色是：（a）告訴你突變落在哪個信心帶、要不要提前警戒；（b）告訴你 enhanced sampling 的預算該花在哪一段。報告 pLDDT 時一律附 domain 級聚合值與「≥ 70 的殘基比例」，並且永遠同時附 PAE 的 domain 區塊圖 —— 只放 pLDDT 不放 PAE，等於只回答了一半的問題。
09Reviewer Thinkingreviewer 會問什麼
你用預測結構做過 MD，怎麼證明你的結論不是預測誤差的產物？點開看參考答案
最好的回答是直接把對照攤開：同一組分析、同一組 metric，Chai-1 起始給 0/8 共享、ρ ≈ −0.03，5F9R 晶體起始給 3/8 共享、Jaccard 0.48、Spearman +0.77。所有生產結果建立在晶體起始上，預測結構只用在不需要精確座標的層次。主動把這個失敗寫進論文比被問出來好，而且它本身就是一個結果。
你那個 RMSF 與 pLDDT 的反相關，會不會只是「兩者都跟溶劑暴露度相關」的假象？點開看參考答案
這是最專業的一問，而且答案必須誠實：ρ = −0.36 的解釋力有限，要排除共同混淆變因，得對 SASA 或接觸數做 partial correlation，這一步沒做，就是一個必須自己講出來的洞。 第二個洞更容易被漏掉：這個 ρ 的兩邊不是同一個系統 —— pLDDT 來自蛋白＋sgRNA＋DNA 的三元預測，RMSF 來自 apo 蛋白的 MD。少了核酸，HNH 周邊的環境本來就不同，所以這個對照只在蛋白端、只在定性層次上成立。在補上 partial correlation 與同系統對照之前，正確的說法是「兩個獨立方法的排序趨勢一致」，不是「pLDDT 反映柔軟度」。承認這兩件事的成本，遠低於被 reviewer 抓到之後的成本。
pLDDT 的 run-to-run 變異多大？你的 62.9 是單次還是多次平均？點開看參考答案
必須報多 seed 的 mean ± SD。如果只有單次，那 62.9 這個數字只能拿來做定性分帶（「HNH 落在 low 帶」），不能拿來跟任何其他數字做小差距的比較。這一條是所有「用 pLDDT 排序變體」的想法的生死線。
你為什麼用 Chai-1 而不是 AlphaFold3？兩者的 pLDDT 可比嗎？點開看參考答案
不可比，而且要說清楚為什麼。pLDDT 是各模型各自訓練出來的自我信心估計，校準不共用；除非你拿同一組 held-out 結構把兩邊都校準過，否則跨模型比絕對值比的是校準差異，不是結構差異。所以我們只在同一個模型內做相對比較。選 Chai-1 的實務理由有二：它把權重與推論程式碼釋出（非商業用途），所以可以在自己的機器上跑、結果可重現、不受第三方服務條款變動影響；以及它原生處理核酸，而 Cas9 三元複合體非得蛋白與核酸兼備不可。
HNH 的 pLDDT 低，你怎麼知道不是 MSA 太淺？點開看參考答案
先講站得住的部分：Cas9 同源序列眾多、也被研究得很透徹，MSA 深度不太可能是瓶頸；而低信心區恰好與實驗上已知的多構形區重合 —— 4UN3 的 checkpoint 構形、5F9R 的 primed 構形、cryo-EM 抓到的中間態。但要誠實：「HNH 低 pLDDT 是因為構形多解、不是 MSA 太淺」這個因果連結查不到直接的文獻出處，它是把兩件各自有文獻的事實接起來的推論，只能當工作假說講，不能當結論引用。要把它變成證據，最直接的做法是自己跑一次預測、附上 SpCas9 的逐殘基 pLDDT 圖，再看 PAE 的形態：HNH 內部乾淨、對外紅，就是「摺疊確定、擺放不確定」的簽名，這個形態比一個平均 pLDDT 更能分辨兩種可能。
10Common Mistakes最常犯的錯
- 只保留預測出來的 PDB，丟掉 pLDDT 與 PAE。 後果：把唯一真正有用的資訊丟了，之後想做交叉驗證得重跑。正解：pLDDT 逐殘基值與 PAE 矩陣一律存檔進版本控制。
- 只看 pLDDT 就宣稱結構可用。 後果：兩塊各自高分的 domain 被擺錯相對位置，而你毫無察覺。正解：任何涉及介面的判斷一律看 PAE 的 off-diagonal 區塊。
- 把 pLDDT 當柔軟度換算。 後果：逐殘基預測錯得離譜，ρ² 只有 0.13 量級的關係被當成函數關係用。正解：只用來排序趨勢，並且畫散佈圖給讀者看點雲有多胖。
- 用單次預測的 pLDDT 差異排序變體。 後果：排的是 seed 雜訊。正解：先量多 seed 的散布，差異小於散布就放棄這個用途。
- 把低 pLDDT 讀成 disordered。 後果：整條推論方向歪掉，跑去做二級結構穩定性分析。正解：分清「摺疊不確定」與「擺放不確定」，用 PAE 區塊判斷。
- 報 HNH 的 pLDDT 只給平均值。 後果：62.9 這個平均掩蓋了分布是分裂的。正解：同時報「≥ 70 的殘基比例」，上面那個例子的答案是 35%。
- 跨模型比較 pLDDT 絕對值。 後果：校準不同，比出來的是模型差異不是結構差異。正解：同模型內比較，或改用實際的結構偏差量。
11Further Reading讀哪幾篇
12Summary三句話
pLDDT 是模型對自己每個殘基局部準確度的預測值，它是局部量、對 domain 之間的相對擺放幾乎是盲的，要問介面該看的是 PAE（疊合在殘基 y 上時殘基 x 的預期位置誤差）與 ipTM。在 SpCas9 上它的誤差分布極不隨機：REC lobe 有 78 到 85、RuvC-I 有 80，但 HNH 只有 62.9（僅 35% 的殘基達到 70）、target DNA 64 到 65、L1 linker 區段 765 到 809 低到 46，而蛋白端的低信心區恰好就是 MD 量到最會動的地方，逐殘基反相關為 ρ = −0.36。結論不是「預測沒用」，而是它的座標不能坐在生產 MD 的上游（Chai-1 起始給出 0/8 共享、ρ ≈ −0.03 的隨機結果），但它的信心分布本身是一個近乎免費、可與 MD 和序列保守性交叉驗證的訊號，該放在 funnel 最前面當分級器與指路標。